新型双胍衍生物1-正戊基-5-(4-三氟甲氧基苯基)双胍联合奥希替尼抑制膀胱癌细胞增殖<sup>★</sup>

彭妍，周晓辰，谢乐静，章行健，肖迪，杨小平; PENG Yan; ZHOU Xiaochen; XIE Lejing; ZHANG Xingjian; XIAO Di; YANG Xiaoping

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新型双胍衍生物1-正戊基-5-(4-三氟甲氧基苯基)双胍联合奥希替尼抑制膀胱癌细胞增殖^★ PDF

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彭妍
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周晓辰
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谢乐静
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章行健
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肖迪
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杨小平
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湖南师范大学医学院小分子靶向药物研究与创制湖南省重点实验室，湖南长沙，410013

中图分类号： R737.14

最近更新：2024-03-27

DOI：10.3969/j.issn.2095-1264.2024.01.09

摘要

目的

探讨新型双胍衍生物1-正戊基-5-（4-三氟甲氧基苯基）双胍（5C）、奥希替尼单用及联用对膀胱癌的抑制作用及机制。

方法

采用MTT实验、细胞克隆实验检测5C、奥希替尼单用及联用对膀胱癌细胞增殖、集落形成的影响。采用Western blotting检测5C联合奥希替尼对表皮生长因子受体（EGFR）及其下游信号通路的影响。

结果

5C、奥希替尼单用均可显著抑制膀胱癌细胞增殖和集落形成，且二者联用能更好地抑制膀胱癌细胞的增殖与集落形成能力。机制研究表明，5C与奥希替尼联用能显著抑制EGFR及其下游信号通路Akt/Erk的磷酸化。

结论

5C联合奥希替尼可通过下调EGFR及其下游信号通路抑制膀胱癌细胞生长。

关键词

膀胱癌; 奥希替尼; 双胍类衍生物; 联合用药; EGFR

0 前言

膀胱癌是指发生于膀胱黏膜的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。根据世界卫生组织（World Health Organization， WHO）发布的2020年全球癌症统计数据显示，膀胱癌的发病率居第十位，而且在男性中其新发病例与死亡率均位于前十^［

1］。近年来，膀胱癌发病率不断增长^{［参考文献 2

百度学术}2］，各种治疗手段也层出不穷。膀胱癌分为非肌层浸润型和肌层浸润型，目前的主要治疗措施是手术治疗，如激光、电切、全膀胱切除等，但均具有较高的复发率及严重的不良反应，且患者在手术治疗后还需要进行药物灌注以预防复发^{［参考文献 3

百度学术}3］。自从30多年前卡介苗免疫保守治疗发展以来，很少有新的膀胱癌治疗方法被发现，而目前全球正在面临着卡介苗短缺的问题^{［参考文献 4

百度学术}4］。因此，寻找治疗膀胱癌的新型药物十分重要。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）家族是一类重要的酪氨酸激酶受体，可通过介导细胞外信号的反应调控细胞增殖、分化和迁移，在膀胱癌、肺癌、肠癌、头颈部肿瘤等多种肿瘤组织中高表达^［

5］。研究表明，EGFR下游信号通路PI3K/Akt/mTOR及RAS/RAF/Erk异常激活可促进细胞生长和增殖^{［参考文献 6-7}6-7］。以奥希替尼为主的第三代EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor， TKI）具有强效的不可逆性和选择性，对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）具有良好的治疗效果^{［参考文献 8-9}8-9］，但在膀胱癌中暂无相关报道。

以二甲双胍为主的双胍类药物是目前临床治疗2型糖尿病的一线用药。近年来，在肿瘤细胞体外实验和小鼠实验中发现，双胍类药物具有显著的抗肿瘤作用^［

10］。尽管目前已有大量研究结果证实二甲双胍治疗膀胱癌有显著疗效^{［参考文献 11-12}11-12］；并且二甲双胍联合EGFR通道阻滞剂吉非替尼对NSCLC合并2型糖尿病患者预后影响的研究结果表明，二甲双胍既可延长患者的生存期，也可延缓吉非替尼获得性耐药的发生进程^{［参考文献 13

百度学术}13］；二甲双胍联合厄洛替尼对人肺癌细胞也表现出良好的抑制作用^{［参考文献 14

百度学术}14］，但目前二甲双胍治疗膀胱癌的适应证仍未获批。最主要的原因是，二甲双胍发挥抑制肿瘤作用的最低浓度为2 mmol·L^-1，而二甲双胍多采用传统的口服给药，这种给药模式使膀胱局部有效药物浓度低于治疗浓度，无法达到抑制膀胱癌细胞生长所需浓度^{［参考文献 15

百度学术}15］，并且口服二甲双胍会导致血液中乳酸含量增加，造成乳酸中毒^{［参考文献 16

百度学术}16］。

为了优化双胍类药物，本实验室前期合成了一系列新型含氟双胍衍生物，并发现新型双胍衍生物1-正戊基-5-（4-三氟甲氧基苯基）双胍（5C）对膀胱癌具有极好的生物活性。本研究旨在研究5C、奥希替尼单用及联用对于膀胱癌的抑制作用和机制。

1 材料与方法

1.1 化学合成

将50 g （0.56 mol） NaN（CN）₂溶于430 mL水中配制成溶液，在80 ℃条件下加入4-三氟甲氧基苯胺溶液［将45 g （0.3 mol） 4-三氟甲氧基苯胺溶于132 mL水和23.5 mL浓HCl］，维持80 ℃持续反应1 h。待反应液中逐渐析出白色粉末状固体，TLC检测显示反应液中不含4-三氟甲氧基苯胺，即为反应结束。将反应液过滤、真空干燥，得1-（4-三氟甲氧基）苯基-3-氰基胍，收率为95.5%。

在25~35 ℃条件下将9.12 g （0.04 mol）1-（4-三氟甲氧基）苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48 mL四氢呋喃（tetrahydrofuran， THF）和40 mL水中，随后加入6.8 g （0.085 mol）五水硫酸铜和16 mL（0.16 mol）正戊胺，加热至40 ℃，持续搅拌反应。TLC检测显示反应液中不含1-（4-三氟甲氧基）苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25~30 ℃，加入HCl溶液（取20 mL浓HCl溶于32 mL水）并搅拌30 min，滴加冷却的氨性乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）溶液［32 mL水、15 mL氨水（25%）和14 g EDTA二钠盐］至反应混合物中，保持温度为15~20 ℃，然后在相同温度下搅拌30 min。过滤分离的产物，用冷水反复洗涤，90~95 ℃干燥，得到白色固体6.85 g，收率为56.9%。

1.2 细胞培养与处理

本研究所使用的膀胱癌细胞株T24和J82均购自上海赛百慷生物。将细胞培养于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中。传代时，首先去除培养瓶中的原有培养基，PBS清洗2遍，加入适量胰蛋白酶并使其均匀覆盖培养瓶底部，置于培养箱中约1 min。待细胞消化完成后，加入适量完全培养基，吹打均匀瓶内细胞，再全部转移至15 mL离心管中，1 200 r·min^-1离心5 min。弃上清，用培养基再次将沉淀细胞吹打均匀后转移至新培养瓶中，再加适量培养基用于传代；保留对数生长期细胞用于后续实验种板。

1.3 MTT实验

将细胞以6.0×10³个/孔加入96孔板，在含10%胎牛血清的培养基中培养12 h后，单独用药组分别使用0.5、1、2、4、8 µmol·L^-1的5C、奥希替尼处理；联合用药组使用0、1、2 µmol·L^-1的5C和0.5、1、2、4、8 µmol·L^-1的奥希替尼处理72 h。随后，将MTT（Sigma公司）溶于PBS使其终浓度为2 mg·mL^-1，取50 µL加入96孔板，孵育5 h。最后，向平板中加入150 µL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）溶解晶体，用酶标仪（BioTek公司）测定490 nm波长处吸光度。

1.4 克隆实验

将细胞以8.0×10³个/孔加入24孔板中培养24 h后，单独用药组分别使用0、1、2、4 µmol·L^-1的5C、奥希替尼处理细胞，联合用药组使用1 µmol·L^-1的5C和奥希替尼处理细胞，继续培养6~8 d。随后，去除24孔板中的培养基和药物，并用PBS清洗剩余的死细胞。向孔中加入10%甲醛溶液固定细胞1 h，最后加入0.1%结晶紫观察1 h，用酶标仪测定550 nm波长处吸光度。

1.5 Western blotting

分别使用1 µmol·L^-1的5C、奥希替尼单独或联用处理细胞，提取细胞中的总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分离蛋白，然后转移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜上，加入5%脱脂牛奶封闭，然后与p-EGFR、p-Akt、p-Erk1/2和β-actin在4 ℃下孵育过夜，TBST洗涤30 min后加二抗孵育，PBS冲洗，ChemiDoc系统观察抗原-抗体反应，Image J定量条带强度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，实验数据以“均数±标准差”（ $\bar{x}$ ±s）表示，组间比较采用Student's t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5C抑制膀胱癌细胞增殖与集落形成

MTT结果显示，随着5C浓度增加，膀胱癌细胞增殖活力显著降低（图1A），而克隆实验结果进一步证明5C可抑制膀胱癌细胞集落形成（图1B），表明5C对膀胱癌细胞的增殖与集落形成能力有显著抑制作用。

图1 5C抑制膀胱癌细胞增殖与活力（n=3, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001）

Fig. 1 5C inhibits the proliferation and viability of bladder cancer cell lines (n=3, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001)

2.2 奥希替尼抑制膀胱癌细胞增殖与集落形成

MTT结果显示，经奥希替尼处理后，膀胱癌细胞增殖活力明显减弱，并呈浓度依赖性（图2A）；克隆实验结果显示，奥希替尼能够明显抑制膀胱癌细胞的集落形成能力，并与药物浓度呈正相关（图2B），表明奥希替尼能够显著抑制膀胱癌细胞的增殖与集落形成能力。

图2 奥希替尼抑制膀胱癌细胞增殖与活力（n=3, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001）

Fig. 2 Osimertinib inhibits the proliferation and viability of bladder cancer cell lines (n=3, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001)

2.3 5C联合奥希替尼抑制膀胱癌细胞增殖与集落形成

MTT结果显示，5C与奥希替尼在多个联用浓度下对膀胱癌细胞的增殖均具有良好的抑制效果（图3A~图3D）；克隆实验结果显示，联合用药能够更加明显地抑制膀胱癌细胞的集落形成能力（图3E），表明5C联合奥希替尼是膀胱癌的潜在治疗方案。

图3 5C增强膀胱癌细胞对奥希替尼的敏感性（n=3, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001）

Fig. 3 5C enhances the sensitivity of bladder cancer cells to osimertinib (n=3, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001)

2.4 5C联合奥希替尼下调EGFR及其下游信号通路抑制膀胱癌细胞生长

Western blotting结果表明，5C与奥希替尼均可下调EGFR及Akt、Erk1/2的磷酸化水平，且二者联用效果更为显著（图4），表明5C与奥希替尼可通过下调EGFR及其下游信号通路抑制膀胱癌细胞生长。

图4 各组膀胱癌细胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk1/2蛋白表达水平比较（n=3, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001）

Fig. 4 Comparison of the protein expression levels of p-EGFR, p-Akt, p-Erk1/2 in bladder cancer cells in different treatment groups (n=3, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001)

3 讨论

膀胱癌具有较高的发病率与死亡率。目前，临床主要通过手术及卡介苗保守治疗等手段来治疗膀胱癌，但复发率与不良反应发生率极高。近年来，有研究表明，双胍类药物对恶性肿瘤具有良好的抑制作用^［

6］。双胍类药物因其治疗膀胱癌疗效好、不良反应少的优势而备受关注^{［参考文献 17

百度学术}17］。本研究首先探究了实验室设计的新型双胍类衍生物5C对膀胱癌细胞的作用，通过MTT实验和克隆实验观察到，5C既能够抑制膀胱癌细胞的增殖活力，也能抑制其克隆形成能力，且这种抑制作用呈现明显的浓度依赖性；Western blotting结果显示，5C可以抑制EGFR的磷酸化，从而下调其下游增殖相关蛋白Akt、Erk的磷酸化水平，最终达到抑制膀胱癌细胞增殖的目的。EGFR家族是在肿瘤中研究比较多的一类重要的酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinasee， RTK），有研究表明其在膀胱癌组织中过表达^{［参考文献 18-19}18-19］。奥希替尼与EGFR相关基因结合后，可以通过阻断突变EGFR同源二聚化或诱导EGFR突变细胞降解来阻断EGFR下游信号传递，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用^{［参考文献 20

百度学术}20］，但其在膀胱癌中的研究较少。为了探究奥希替尼在膀胱癌中的作用，我们使用奥希替尼处理膀胱癌细胞，MTT实验和克隆实验结果显示，其能明显抑制膀胱癌细胞的增殖活力与集落形成能力，并与浓度呈正相关；Western blotting结果也表明，奥希替尼可通过抑制EGFR及其下游信号通路抑制膀胱癌细胞增殖。由于5C及奥希替尼均通过抑制EGFR及其下游信号通路抑制膀胱癌细胞增殖，我们进一步探讨了5C能否增强膀胱癌细胞对奥希替尼的敏感性。正如我们预期的那样，5C联合奥希替尼可进一步抑制膀胱癌细胞增殖。

综上所述，5C联合奥希替尼可通过抑制EGFR及其下游信号通路的活化抑制膀胱癌细胞增殖，这可能为膀胱癌提供新的潜在治疗方案。

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